阴道微生态的分子生物学研究

女性阴道是个体局部免疫的一个重要组成部分，现有研究表明：阴道菌群是一个复杂、独特和动态变化的微生态系统，由阴道的解剖结构、微生物菌群、局部免疫系统及机体的内分泌调节功能共同组成。在健康女性阴道内，存在大量、正常的微生物，如乳杆菌等，这些细菌对于维持宿主与环境的平衡，协调宿主阴道功能和保持阴道微生态平衡，发挥着至关重要的作用。早期关于阴道内微生态菌群的认知，仅局限于传统的细菌培养的方法，对于阴道内细菌组成、细菌功能的了解，缺乏完整的认识。近年来，分子生物学技术得到快速发展，特别是以高通量测序为代表的宏基因组学技术的突破，为阴道微生态研究提供了全新的方法和思路，使人们对阴道菌群的结构及功能特性的认知取得了突破性的进展。本文对目前应用于阴道微生态的不同分子生物学方法进行解析、对阴道微生态菌群的研究现状进行回顾，并对未来的研究方向进行展望。

1. 阴道微生态研究的常见分子生物学技术 

1.1  传统的基于16S rDNA/rRNA靶向的分子生物学技术

1.1.1  克隆文库技术 克隆文库构建是指从微生物环境中提取总DNA，然后利用细菌16S rRNA种特异性引物，获得细菌16S rRNA基因片段，并将PCR产物与载体分子重组，重组后转化宿主细胞，转化细胞在选择培养基上生长出的单个菌落即为一个DNA片段的克隆。通过分析文库中标记序列的类型和出现频率得到种群组成信息，与GenBank 中的序列进行比对，确定其在进化树中的位置，从而确定样品中微生物群落的组成。Zhou等首次应用该技术对美国5例健康女性阴道微生物群落分布特征进行了研究。结果显示：阴道微生物群落的分布存在较大个体差异，其中4例女性阴道优势菌为乳杆菌属（卷曲乳杆菌或惰性乳杆菌），而另一例女性阴道优势菌为奇异菌属。通过构建克隆文库的方法首次在健康女性阴道内发现了巨球菌属、纤毛菌属、奇异菌属的存在。我们课题组也曾应用该方法初步研究了北京地区育龄女性阴道内优势乳杆菌为卷曲乳杆菌、加氏乳杆菌和惰性乳杆菌。

16S rRNA克隆文库技术是应用最为广泛的菌种鉴定技术之一，它可以提供许多无法培养或难以培养的微生物的信息，准确度高，但由于该方法工作量大，不适合单独应用于阴道微生态菌群构成多样性的分析，常与其他分子生物学技术联用，从而确定微生物种群优势菌的具体种属信息。

1.1.2  16S  rRNA指纹图谱技术 随着分子生物学技术的不断发展，DNA遗传指纹图谱技术为研究菌群结构及其动态变化提供了有效的手段。目前，常用的DNA遗传指纹图谱技术主要有以下4类：变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）、末端限制性片段长度多态性（terminalrestriction fragment length polymorphism，T-RFLP）、单链构象多态性（single stranded conformation polymorp hism，SSCP）和随机扩增多态性（DNA random amplified polymorphic DNA，RAPD）。其中，末端限制性长度多态性和变性梯度凝胶电泳已应用到阴道微生态的研究中。

末端限制性片段长度多态性（RFLP）分析，是一种利用限制性酶切片段长度差异来检测生物个体之间差异的分子标记技术。通过PCR扩增16S rRNA基因，再将扩增产物经限制性内切酶消化，消化后的样品进行琼脂糖凝胶或丙烯酰胺凝胶电泳分析，存在核酸序列差异的不同种群微生物的PCR产物其酶切片段的数量和大小各不相同，于是电泳图谱呈现多态性。2005年，Coolen等首次用T-RFLP的方法在对健康女性阴道微生物群落多样性进行研究，结果显示：不同个体阴道群落的多样性和相对构成比保持相对稳定。2007年Thies等利用该技术对50例细菌性阴道病（BV）和20例健康人阴道微生物群落的研究发现，BV阴道中可分离出17属的23种细菌，主要包括阴道阿托波菌、巨球菌属、惰性乳杆菌、阴道加德纳菌以及3种梭菌属细菌。Zhou等利用该方法先后对北美144例高加索白人、黑人妇女以及日本健康女性的阴道菌群进行了对比研究。结果显示：北美高加索白人、黑人和日本健康女性阴道菌群的构成有一定的相似性，最常见的优势菌种为惰性乳杆菌、卷曲乳杆菌、詹氏乳杆菌和加氏乳杆菌。但是，不同种族间也有差异，黑人妇女相对于白人妇女和日本妇女阴道乳杆菌检出率低，且菌种单一。

变性梯度凝胶电泳技术是近年来国内外应用比较广泛的分子生物学技术之一。这一方法的原理是先在体外循环进行DNA模板解链、引物与DNA模板结合、DNA聚合酶催化形成新的DNA链，以此来快速扩增目的基因或DNA序列。在这个基础上，根据双链DNA分子碱基组成的差异，在变性凝胶电泳时所需不同的变性剂梯度而滞留于凝胶的不同位置，形成相互分开的谱带，从而可以分离大小相近的DNA片段，检测到只有一个碱基差异的DNA片段，进而通过凝胶上形成条带的数目和丰度反映微生物多样性信息，然后与GenBank中的标准序列进行比较，就可以得出它们的遗传相关性。2002年，Burton等首次应用PCR-DGGE技术并结合Nugent评分、种特异性PCR方法对20例绝经后女性的阴道菌群进行了研究，结果显示：Nugunt评分正常的人，阴道内的优势菌为1～3种，经测序后显示均为乳杆菌属，其中以惰性乳杆菌、卷曲乳杆菌和加氏乳杆菌最常见；而Nugent评分异常的人阴道群菌多样性增加，可见到大肠杆菌、普雷沃菌属、拟杆菌等。Anukam等对185例尼日利亚健康育龄女性阴道菌群进行了研究，结果显示：最常见阴道优势菌种为惰性乳杆菌，其次为加氏乳杆菌、植物乳杆菌、酸面团乳杆菌、卷曲乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、阴道乳杆菌、发酵乳杆菌、约氏乳杆菌。我们课题组也应用该方法首次对中国健康女性的阴道菌群多样性进行了分析。

1.2  目前针对细菌的分子生物学检测技术

1.2.1  针对单一、多个致病菌的实时荧光定量PCR检测技术  实时荧光定量PCR（Real-time polymerasechain reaction）技术是定量PCR（QPCR）的一种，简称为QRT-PCR，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。常规PCR由于本身的平台效应不能够进行精确定量，而荧光定量PCR由于利用扩增进入指数增长期的Ct值来定量起始模板的量，真正反映产物含量与模板浓度直接关系，使得整个PCR过程中的产物含量随时得到监测成为了可能，实现了极为精确的核酸定量检测。RT-PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems 公司推出，其问世实现了PCR从定性到定量的飞跃。由于该方法高效、准确的定量特性，目前，已成功用于阴道微生态菌群的定量分析。

De Backer等采用核酸荧光染料实时定量PCR对阴道标本中的加德纳菌、阿托波菌和4种乳酸杆菌（卷曲乳酸杆菌、加氏乳酸杆菌、詹氏乳酸杆菌和惰性乳酸杆菌）进行定量检测，通过对上述细菌不同稀释倍数的阳性模板做定量检测，绘制标准曲线，将待测样品与标准曲线进行比较得出定量结果。

与常规细菌鉴定方法相比，实时定量PCR技术实现了质的飞跃，检测细菌遗传物质不需要活的病原体，不受时间的限制。但其局限性在于需要已知细菌16S rRNA特异序列并据此设计引物和探针，不能对未知细菌进行检测，且建立定量PCR标准曲线时需要纯培养的标准菌株作为模板。所以，在应用于阴道菌群研究时，RT-PCR还需要与传统的研究方法配合使用，才能发挥更高的功效。

1.2.2  针对多细菌的16S rDNA高通量测序技术  2005年底，454公司推出了革命性的基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统——Genome Sequencer 20 System，被《Nature》杂志以里程碑事件报道，开创了新一代测序技术的先河。目前，Illumina公司HiSeq 2000，ABI公司SOLID和Roche公司454为代表的高通量测序技术统称为第二代测序技术或新一代测序技术（next-generation   sequencingtechnology）。该方法的原理是在焦磷酸测序的反应体系中存在4种酶，分别为DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶，反应底物为5′-磷酰硫酸以及荧光素，在反应体系中还包括待测序DNA单链和测序引物。当引物与模板DNA复性后，在上述4种酶的协同作用下，每一个dNTP的聚合会与1次荧光信号的释放偶联起来，最终以荧光信号的形式实时记录模板DNA的核苷酸序列。焦磷酸测序的出现在文库制备、模板制备、测序三大困扰一代测序的瓶颈上取得了巨大的突破。真正做到了低价大规模平行测序反应。

1.3  基于全基因组学的分子生物学技术  要想在阴道菌群方面研究实现新的跨越，需要以大规模基因组学研究作为向导，从而通过宏基因组的数据来深入研究阴道菌群的功能。宏基因组学（metagenomics）是一门直接研究自然状态下微生物群落（包含了可培养的和不可培养的细菌、真菌和病毒等基因组的总和）的学科。它的出现进一步拓展了人类研究阴道菌群的深度和广度，为阴道菌群方面研究提供了新的思路。

2.阴道微生态研究的现状及热点 

2.1  正常阴道微生态菌群  2011年，Ravel等首次应用焦磷酸测序技术对396个无症状育龄期北美女性阴道微生态菌群的构成进行分析，第一次提出阴道微生态菌群可分5型：CST Ⅰ型（L.crispatus 优势菌群）、CST Ⅱ型（L.gasseri 优势菌群）、CST Ⅲ型（L.iners 优势菌群）、CST Ⅳ型（厌氧菌为优势菌群，乳杆菌含量无或低，其中Ⅳ-A以Anaerococcus，Peptoniphilus，P.bivia 等为主，Ⅳ-B以阴道阿托波氏菌和巨型球菌属为主）和 CST V型（以L.jensenii为优势菌群）。且不同种族（白人、黑人、亚裔、拉丁裔）人群中的乳杆菌特征与其阴道健康状态具有显著差异。此后，Brotman等、Romero等、Hickey等分别对健康的青春期、孕期、绝经期女性阴道菌群进行报道。女性一生中受各种内源性（激素、月经、妊娠、种族、遗传等）因素的影响，阴道菌群始终处于一种动态变化的过程中。了解健康女性阴道微生态是研究各种疾病的基础，因此，随着分子生物学技术的不断进步，关于不同生理状态、不同种族“阴道正常菌群”的概念也在不断的更新完善中。

2.2  细菌性阴道病的病因  细菌性阴道病（Bacterial vaginosis，BV）是育龄期女性常见的下生殖道感染性疾病，它的反复发作和持续感染会增加发生宫颈癌和感染人类免疫缺陷病毒（HIV）的风险，近年来越来越引起临床及科研学者的关注。Fredricks等在2005年新英格兰杂志上报道了BV患者阴道内可检出BV相关细菌1（BV-AB1）、BV相关细菌2（BV-AB2）和BV相关细菌3（BV-AB3）、巨球菌属等20余种细菌，开启了应用分子生物学方法诊断及研究细菌性阴道病的新纪元。Bradshaw等、Ferris等、Marrazzo等分别对复发的BV患者阴道菌群进行研究，指出在复发人群中阴道阿托波菌、克氏动弯杆菌、加德纳菌检出率较高。Onderdonk等的研究也指出普雷沃菌、奇异菌属等许多细菌是细菌性阴道炎的潜在致病菌，且细菌性阴道炎的病因在不同患者身上不一致。我们团队前期也进行了相关的研究，并提出细菌性阴道病的菌群存在不同亚型，且与治疗结局存在相关性。今后对于细菌性阴道病的病因还需要更多深入的研究。

2.3  阴道微生态与其他疾病或临床治疗的相关性研究

2.3.1  微生态与宫颈炎  Austin等的研究指出宫颈炎发病与Mageeibacillus indolicus菌相关，无宫颈炎女性阴道詹氏乳酸杆菌丰度更高。van der Veer等选取98例与沙眼衣原体阳性的性伴侣接触过的女性，分析其宫颈及阴道菌群，指出多样化的厌氧菌或惰性乳酸杆菌与沙眼衣原体感染相关。

2.3.2  微生态与早产  感染与早产是一个古老的话题，Kindinger等最新的研究评估了阴道菌群、宫颈长度及阴道孕激素治疗与早产风险之间的相关性，提出了一些新的理念。研究显示，在妊娠期第16周时，如果惰性乳酸杆菌在阴道菌群中占优，会与宫颈长度＜25 mm及＜34周的早产相关；如果孕16周时卷曲乳酸杆菌占优，则可高度预测胎儿可足月出生；宫颈长度缩短及早产与阴道菌群失调无关；孕激素治疗不会改变阴道菌群结构，且不会降低惰性乳酸杆菌相关的早产风险。

2.3.3  微生态与HIV  Cohen2016年发表在《Science》上并在第21届国际艾滋病大会上宣布阴道菌群组成影响HIV易感性，这可能可以解释为何暴露前预防在男性中效果更好；接受暴露前预防试验时仍然感染HIV的女性的阴道菌群与未感染HIV的女性相比，乳酸杆菌显著减少。Gosmann等的研究也显示在南非的年轻女性中，生殖道细菌群落多样性较高的女性感染HIV的概率是生殖道菌群以卷曲乳酸杆菌为主的女性的4倍；在具有高危生殖道菌群的女性中，活化的黏膜CD4+T细胞数量增加；卷曲乳酸杆菌与HIV感染风险降低相关，普氏菌属、纤毛菌属及其他厌氧菌与HIV感染风险升高相关。这一报道再次掀起了阴道微生态与HIV相关性研究的新高潮。

2.3.4  微生态与妇科肿瘤  阴道菌群与妇科肿瘤的关系尚未完全阐明。目前已知持续性感染HPV是宫颈癌发病的必要非充分条件，越来越多的证据表明阴道菌群在HPV感染中及宫颈癌发病中扮演了重要角色。HPV感染女性阴道菌群多样性增加，尤其加氏乳酸杆菌和阴道加德纳菌丰度增加。梭菌属（Fusobacteria），包括纤毛菌属（Sneathia），与HPV感染最为相关。机体最终清除HPV，还是发生HPV相关恶性转化，也取决于阴道菌群结构。对患有宫颈鳞状上皮病变的女性的阴道菌群分析发现菌群紊乱与CIN的级别有相关性。卵巢癌发病可能同样受到阴道菌群的间接调控，通过局部炎性反应或免疫监测。研究显示，卵巢和输卵管拥有特殊菌群，上皮性卵巢癌患者与健康女性上生殖道菌群组成不同。此外，子宫菌群组成与子宫内膜癌发病相关。阴道阿托波菌和卟啉单胞菌（Porphyromonas）也参与妇科恶性肿瘤发生。

2.3.5  微生态与辅助生殖技术  辅助生殖技术在过去10年间有了巨大进步，然而仍然有相当一部分女性即使拥有染色体正常的囊胚却无法生育。Moreno等的研究显示，子宫内膜菌群对体外受精卵植入成功或失败有一定的影响，子宫内膜中非乳酸杆菌占主要地位的菌群，与植入、怀孕、持续妊娠、婴儿出生的概率显著降低相关。Franasiak等综述了人体菌群对生育的影响，通过对宏基因组样品的分析，不仅发现人体生殖道并非是过去认为的那样是无菌的，并且鉴定出了正常及异常的阴道与子宫内膜菌群。目前，我们对人体生殖道菌群的了解还十分有限，更好地理解生殖道菌群失调对生育十分重要。

3.展望  

目前，应用分子生物学技术开展的阴道菌群研究还在不断的发展，新的测序技术及手段如雨后春笋般不断涌现，第115届美国微生物学会大会上曾提出人类基因组和宏基因组的高通量测序数据将成为今后研究的重点，开发用于诊断、治疗和公共健康的临床基因组学将在感染性疾病诊断和公共健康微生物学研究中扮演重要的角色。目前，国内外学者已开始利用新一代测序技术分析阴道微生物组成、并评估其作为阴道炎临床诊断工具的可能性，研究阴道用益生菌在预防和治疗肿瘤方面发挥的直接作用。我相信未来关于阴道微生物群落与炎症和肿瘤的研究一定能够获得在健康与疾病方面的既独特又新颖的见解。（参考文献略）